Bioassay-guided fraktionering

Sharing is caring

Naturstoffer er en stor kilde til udvikling af lægemidler og her er bioassay-guided fraktionering en udbredt metode til at identificere, hvilke stoffer i en plante der er aktive. Det er en metode hvor man oprenser kemiske stoffer fra et ekstrakt ved fraktionering og bestemmer den biologiske aktivitet af en given fraktion ved hjælp af bioassays. Det er biologiske test, hvor man anvender celler eller proteiner til at teste om et bestemt stof udløser en bestemt biologisk virkning.

Først gælder det om at få fremstillet et ekstrakt af planten, som indeholder de stoffer som kan have et potentiale. Ekstraktionen udføres ved at behandle planten med et velegnet solvent, der er i stand til at opløse de interessante stoffer fra planten, så de kommer over i solventet. Hvilket solvent der vælges til ekstraktion, afhænger af de stoffernes polaritet, således at man anvender polære solventer til polære stoffer og upolære solventer til upolære stoffer. Hvilket solvent man skal vælge, kan være en udfordring, hvis man ikke kender stoffernes kemiske egenskaber. Her kan anvendes en ekstraktionsteknik, hvor man anvender flere solventer med forskellig polaritet. Ofte starter man med det mest upolære solvent og fortsætter så med solventer der bliver mere og mere polære, indtil man har fået ekstraheret alle de ønskede stoffer.

Resultatet af ekstraktionen er en opløsning af de ønskede stoffer fra planten i solventet. Bagefter fjerner man solventet igen ved rotationsfordampning, hvorefter man har et ekstrakt man kan anvende til videre undersøgelse. Den biologiske aktivitet af ekstraktet bestemmes, ved at anvende et bioassay.

Herefter skal ekstraktet oprenses til de forskellige bestanddele, så man kan finde ud af hvad det er for nogle stoffer i ekstraktet der har en biologisk virkning. Her kan anvendes forskellige fraktioneringsmetoder, hvor man får opdelt ekstraktet i forskellige fraktioner baseret på deres kemiske egenskaber. Her anvendes ofte søjlechromatografi, hvor man adskiller de forskellige stoffer i ekstraktet, på baggrund af deres forskelle i polaritet. Man fremstiller en søjle pakket med en stationær fase, typisk silica. Så tilsætter en mobil fase af solvent løbende, så søjlen hele tiden holdes våd og den mobile fase løber gennem søjlen. Ekstraktet opløses ligeledes i solventet og tilsættes søjlen, hvorefter man fortsætter med at tilsætte mere af den mobile fase. Den mobile fase får ekstraktet til at løbe ned gennem søjlen, for til sidst at kunne opsamles i bunden af søjlen. Undervejs ned gennem søjlen, vil nogle stoffer i ekstraktet binde mere til silica end andre stoffer, fordi de er mere polære. Dette betyder at de upolære stoffer kommer tidligere ud af søjlen, end de upolære stoffer. Således vil de upolære stoffer blive opsamlet i de første fraktioner og de polære stoffer i de sidste fraktioner. Resultatet af søjlechromatografi er altså en række fraktioner, hvor stofferne i ekstraktet er opdelt efter polaritet.

Valget af stationær fase og mobil fase afhænger selvfølgelig også af de kemiske egenskaber af stofferne i ekstraktet. Som den mobile fase anvendes ofte en blanding af flere solventer, hvor det gælder om at finde den perfekte blanding af solventer, der er bedst til at adskille stofferne i ekstraktet. Fraktionerne kan undervejs monitoreres af tyndtlagschromatografi (TLC), hvor man tager en lille prøve af en fraktion og påsætter på en TLC plade med silica. Herefter sættes pladen ned i et bægerglas, hvor der i bunden af glasset er et solvent, kaldet eluenten. Eluenten vil så løbe op af TLC-pladen og trække stofferne i pletten på TLC-pladen med op. Herved vil der ske en adskillelse af stofferne i prøven efter deres polaritet, og man vil kunne se om stofferne i ekstraktet er blevet tilstrækkeligt oprenset.

Herefter testes fraktionerne igen af et bioassay, for at teste for deres biologiske aktivitet. Herved finder man ud af hvilke fraktioner der har den biologiske aktivitet. Derved finder man også ud af hvilke fraktioner man bør oprense yderligere. For hver oprensning testes ved bioassay igen, og man fortsætter denne cyklus til man til slut har fuldt oprensede stoffer, der har en biologisk aktivitet. De oprensede stoffers kemiske struktur kan herefter bestemmes ved forskellige spektroskopimetoder, herunder NMR-spektroskopi, IR-spektroskopi og Massespektroskopi.

Princippet bag bioassay-guided fraktionering
Princippet bag bioassay-guided fraktionering

Sidst opdateret 4. juni 2017